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灵芝化学成分与质量控制方法研究
作者: |  来源:中菌协  | 发布时间:2015-11-27 | 浏览次数:1118次    


灵芝化学成分与质量控制方法研究

陈若芸

(中国医学科学院 北京协和医学院 药物研究所,天然药物活性物质与功能国家重点实验室,北京,100050)

  摘要:本文对灵芝活性成分和质量控制方法的研究进行了综述。

  关键词:灵芝; 三萜化合物;甾醇;质量控制;指纹图谱

  灵芝属(Ganoderma)真菌属于多孔菌科(Polyporaceae)药食兼用菌,全世界有108种。在我国共有76种,包括灵芝亚属(55种)、树舌灵芝亚属(20种)和粗皮灵芝亚属(1种)三个亚属,其中灵芝亚属又可分为灵芝组(29种)和紫芝组(26种)。
  到目前为止国内外进行过药理和化学研究的灵芝属真菌有以下20余种∶ 赤芝(Ganoderma.lucidium) ; 紫芝(G.japonium) ; 薄盖灵芝(G.capense) ; 南方灵芝(G.australe) ; 松杉灵芝(G.tsugae); 树舌(G.applanatum) ; 热带灵芝(G.tropicus); 长孢灵芝(G.boniense) ; 硬孔灵芝(G. duropora); 无柄灵芝(G. resinaceum); 茶病灵芝(G. theaecolum); 反柄灵芝(G.cochlear);  黑灵芝(G.atrum);台湾灵芝(G.fomosanum);狭长孢灵芝(G.boninense); G.colossum;  G.concinna;  G.amboinense;  G.pefeifferi;G.orbiforme等 [1]。

  一、灵芝化学成分研究

  化学工作研究最多的是赤芝,目前已报道从中分到二百余种化学成分。灵芝化学成分共有九类近300余种化合物。
  (一)三萜类化合物
  从灵芝中分到四环三萜220 余种, 从灵芝四环三萜化合物的结构来看,为高度氧化的羊毛甾烷衍生物。按分子所含碳原子数可分为C30, C27, C24三大类。从赤芝孢子粉中分到8种三萜类化合物,分别是赤芝孢子内酯A、 赤芝孢子内酯B、赤芝孢子酸A、灵芝酸B 、C、 E、 M 、灵芝酮三醇。三萜类化合物是灵芝的主要化学成分之一,很多三萜类化合物具有生理活性。赤芝孢子酸A (Ganosporeric acid A) 对CCL4和半乳糖胺及丙酸杆菌造成的小鼠转氨酶升高均有降低作用。赤芝孢子内酯A(Ganosporelactone A)具有降胆固醇作用。灵芝提取的三萜类化合物能降低CCL4肝损伤小鼠血清GOT、GPT,具保肝作用[2]。
  (二)核苷类化合物
  核苷类是具有广泛生理活性的一类水溶性成分,从薄盖灵芝菌丝体中分离到五种核苷类化合物,分别为尿嘧啶(Uracil), 尿嘧啶核苷(Uridine),腺嘌呤(Adenine), 腺嘌呤核苷(Adenosine)和灵芝嘌呤(Ganoderpurine) [3]。 
  (三)呋喃类衍生物
  灵芝中的呋喃类衍生物是从发酵的薄盖灵芝菌丝体乙醇提取物中分离得到的。分别为5-羟甲基呋喃甲醛(5-Hydroxymethylfurfuraldehyde),  5-乙酰氧甲基呋喃甲醛(5-Acetoxymethylfurfuraldehyde), 5-丁氧甲基呋喃甲醛(5-Butoxymethylfurfuraldehyde),1,1'-二a-糠醛基二甲醚(1,1'-di-a-fur-aldehydicdimethyl ether) [4]。       
  (四)甾醇类化合物
  灵芝中的甾醇含量较高,仅麦角甾醇含量就达千分之三左右。已知从灵芝中分到的甾醇有近二十种,其骨架分为麦角甾醇类和胆甾醇类两种类型,分别是∶麦角甾醇(Ergosterol),麦角甾醇棕榈酸酯(Ergosta-palmitate),5-豆甾烷二酮3,6(5-Stigmastan 3,6-dione), -谷甾醇(-sitosterol),麦角甾7,22-二烯酮-3(Ergosta- 7,22-dien-3-one),麦角甾7,22-二烯-3-醇(Ergosta-7,22-dien-3-ol),麦角甾7,22-二烯-3,5,6-三醇(Ergosta-7,22- dien-3,5,6-triol),麦角甾7,22-二烯-3,5,6-三醇(Ergosta-7,22-dien-3,5,6-triol),麦角甾7,9,22-三烯-3,5,6-三醇(Ergosta-7,9,22-trien-3,5,6-triol),麦角甾4,6,8(14),22-四烯酮-3(Ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one)。另外从松杉灵芝中得到四个麦角甾醇类化合物,分别为麦角甾过氧化物(ergostrol peroxide);麦角甾7,22-二烯-3-酮(ergosta 7,22-dien-3-one);麦角甾7,22-二烯-3-醇(ergosta7,22-dien-3-ol);-谷甾醇(–sitosterol)等[5]。
  (五)生物碱类化合物
  灵芝中的生物碱含量较低。从发酵的薄盖灵芝菌丝体和赤芝孢子粉中分离得到的生物碱有胆碱(Choline),甜菜碱(Betaine)及其盐酸盐,灵芝碱甲(Ganoine),灵芝碱乙(Ganodine),和菸酸(Nicotinic acid) [3]。Liuchao [6], Jie-Qing Liu [7] 等从紫芝中得到sinensine,sinensine B,sinensine C,sinensine D,sinensine E等5个新的生物碱。
  灵芝中的生物碱虽然含量较低,但有些有一定的生物活性,如 -三甲胺基丁酸在窒息性缺氧模型中有提高存活时间的作用,能使离体豚鼠心脏冠流增加。临床上将甜菜碱和N-脒基甘氨酸共用治疗肌无力。
  (六)、氢醌及其他类化合物
  德国学者Ramzi A. A.Mothana [8] 从灵芝属真菌 Ganodema pfeifferi 得到两个法呢基氢醌类化合物,分别为ganomycin A,和ganomycin B 。这两个化合物对格兰氏阳性菌和格兰氏阴性菌均有抑制作用。
  (七)、脑苷及多肽、氨基酸类化合物
  日本学者Yoshiyuki Mizushina等[9]等从赤芝子实体中得到对DNA聚合酶复制有抑制活性的脑苷类化合物(4E,8E)-N-D-2’-hydroxypalmitoyl-1-O--D-glucopyranosyl-9-methyl- 4,8-sphingadienine和(4E,8E)-N-D-2’-hydroxystearoyl-1-O--D-glucopyranosyl- 9-methyl- 4,8-sphingadienine。
  灵芝不同种之间的氨基酸种类相似,只是个自含量不同,并发现赤芝孢子粉中有含硫氨基酸。试验证明天门冬氨酸,谷氨酸,精氨酸,酪氨酸,亮氨酸,丙氨酸,赖氨酸,等可以提高小鼠窒息性缺氧存活时间。我们从赤芝孢子粉中分离得到硫组氨酸甲基内铵盐。                  
  另有学者从灵芝中还分到多肽类化合物,其中有中性多肽,酸性多肽,碱性多肽,其中一种中性多肽可以提高小鼠窒息性缺氧存活时间。
  (八)多糖、糖肽类化合物
  从灵芝中分离得到近二十种多糖和糖肽类化合物,并证明灵芝多糖是其抗衰老扶正固本的有效成分之一。
  (九)有机酸、长链烷烃类化合物
  从灵芝中还得到大量的脂肪酸类等其他化合物,有硬脂酸,棕榈酸,花生酸,二十二烷酸,二十三烷酸,二十四烷酸以及甘露糖和海藻糖等。

  二、质量控制方法研究

  (一)、比色方法测定灵芝总三萜酸含量

  李保明等建立了测定灵芝总三萜酸含量的比色方法[10]。灵芝子实体、灵芝孢子粉用无水乙醇回流提取,提取液经过碱化、酸化后,用氯仿萃取,萃取液经无水硫酸钠干燥后减压蒸干,制成无水乙醇溶液,与硫酸加热产生颜色反应,测定其吸光度值。对照品和样品溶液在526nm处有最大吸收,故选择测定波长为526nm。本法准确、重现性好,样品背景干扰小,适用于灵芝子实体和灵芝孢子粉中总三萜酸的含量测定。
对照品溶液的制备 精密称取灵芝酸B对照品约5mg,置5ml量瓶中,加无水乙醇溶解并稀释至刻度,即得含灵芝酸B约1mg•mL-1的对照品溶液。
  测定结果如下:

表1 灵芝样品中总三萜酸含量(n=2)

 

  (二)、HPLC方法测定灵芝三萜酸:

  马林等建立了测定灵芝四种三萜酸的HPLC方法[11],李保明等[12]建立了9种灵芝三萜酸HPLC含量测定方法,并测定了31种不同产地、不同培养基栽培的赤芝子实体中9种三萜酸含量,该方法快速、重现性好,可作为评价灵芝质量的方法。
  9种灵芝三萜酸对照品均由中国医学科学院药物研究所实验室研制提供,经IR、UV、NMR、MS等光谱鉴定,HPLC分析纯度为98%以上;赤芝(G .lucidum)药材来源及测定结果见表2.

  (三)、灵芝HPLC指纹图谱研究:

  李保明等[13]采用高效液相色谱法对灵芝的指纹图谱进行了研究,利用Agilent1200系统高效液相色谱仪(美国);紫外检测器(DAD),色谱柱为Alltech C18(150×4.6 mm,5 μm),以乙腈-0.04%甲酸梯度洗脱,0~10 min时,乙腈0~20%,10~20 min时,乙腈20~25%,20~50 min时,乙腈25~30%,50~65 min时,乙腈30~38%;流速为1.0 mL•min-1;检测波长为254 nm,柱温15 ℃。15个灵芝三萜对照品均由中国医学科学院药物研究所实验室研制提供,经IR、UV、NMR、MS等光谱鉴定,HPLC分析纯度为98%以上;分析了18个批次的灵芝子实体,并建立了指纹图谱,确定了19个共有峰,包括灵芝酸I(1)、灵芝酸C2(2)、赤芝酸 LM1(4)、灵芝酸G(5)、灵芝烯酸B(6)、灵芝酸B(7)、灵芝烯酸A(9)、灵芝酸A(11)、12-乙酰基-3-羟基-7,11,15,23-四羰基-羊毛甾-8-烯-26-酸(12)、灵芝酸D(13)、赤芝酸A(14)、灵芝烯酸D(15)、灵芝酸C(16)、灵芝酸E(17)、灵芝孢子酸A(19)等15个已知化合物峰以及4个未知化合物峰,有13批灵芝样品指纹图谱与对照指纹图谱相似度均在0.9以上。本试验分别测定了赤芝(G. lucidum)(包括野生和栽培)、松杉灵芝(G. tsugae)、鹿角灵芝(G. amboinense)、紫芝(G. sinense)、硬孔灵芝(G. duropora)等样品,结果显示:紫芝和硬孔灵芝在该实验条件下,没有色谱峰出现;赤芝(栽培)的指纹图谱相似度大于0.92,两个赤芝(野生)分别为0.773和0.909,两个鹿角灵芝分别为0.840和0.942,而松杉灵芝则为0.86。从赤芝的指纹图谱和相似度结果看出,它们的共有峰均为19个,相似度虽有差异,但所含成分基本一致,见图2。在灵芝分类学上,赤芝和松杉灵芝同为灵芝属灵芝组真菌,而紫芝和硬孔灵芝则属于紫芝组,从三萜化合物存在的情况看,二者也有明显的区别,也为灵芝的化学分类提供了参考。
 

表2.  31种灵芝样品中三萜含量测定 

此方法简单、准确、重复性好,为灵芝的质量控制标准提供了有效的方法。

表3.灵芝样品来源

    (四)、高效毛细管电泳法测定核苷类化学成分的含量

灵芝指纹图谱

  戴敬、鲁静 [14]等建立了高效毛细管电泳测定灵芝培养液中核苷类化学成分的方法,测定了其中两种核苷-腺苷和鸟苷的含量。方法为:使用熔融石英毛细管柱,75m id X57cm(有效长度50 cm), 缓冲体系20 mmol• L-1硼砂含30mmol•  L-1十二烷基硫酸钠, 添加 5%乙醇(95%), pH10.0 (1mmol• L-1NAOH调节);气动进样时间15s; 分离电压10kV(恒压方式) ;柱温20 oC; 检测波长254nm 。回归方程 腺苷: Y=0.0705+0.01707X(r=0.9995); 鸟苷:Y=0.0232+0.01864X(r=0.9999)。平均回收率(n=5):腺苷为99.22%, RSD=3.66%; 鸟苷为104.3%, RSD=1.91%。内标为:磺胺甲唑。样品的前处理使用AB-8大孔树脂吸附,30%乙醇洗脱。根据建立的方法,测定了9批灵芝培养液样品中腺苷和鸟苷的含量。腺苷的含量在19.3-23.6g• mL-1之间,鸟苷的含量在12.5-19.8g• mL-1之间。

  (五)、灵芝中甾醇类化合物分析

  王江[15]等用气相色谱测定了鹿角状灵芝和片状灵芝的甾醇含量,灵芝中的甾醇用氯仿提取后,加吡啶和醋酐进行酰化处理,进样分析,以保留时间定性,以峰高定量。仪器为日本岛津GC-9A型气相色谱仪,FID检测器,C-RSA型数据处理机。 色谱条件:玻璃柱2mX3mm,填料2.0%SE-30+1.5% QF-1/chromosorbWAW(60-80目)单体。 柱温245 oC,检测器温300 oC,气化室温300 oC,载气N240ml/min, H20.10Mpa, Air0.07Mpa。以菜油甾醇、豆甾醇、 -谷甾醇为标准品绘制工作曲线,其中鹿角状灵芝甾醇总量为0.79mg/g ; 片状灵芝的甾醇总量为1.04mg/g 。

  (六)、灵芝孢子油中脂肪酸含量测定

  陈体强 [16]等采用气相色谱与质谱(GC—MS)联用分析,从超临界CO2萃取孢子油中鉴定出18种脂肪酸成分,包括6种不饱和脂肪酸、7种饱和脂肪酸、2种环链脂肪酸,以及己酸、辛酸、壬酸等短链脂肪酸。GC定量分析结果表明:灵芝孢子油中检出9种已知脂肪酸,不饱和脂肪酸总量为73.6% ;其中,主体成分油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)和棕榈酸(C16:0)等含量分别为57.5%、13.4%、19.6%;此外,不饱和脂肪酸十六碳烯酸(C16:1)、亚麻酸(C18:3)等不饱和脂肪酸含量为2.2%、0.5%。


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